Генетикалык изилдөөлөрдү жүргүзүү процессинде биз көбүнчө РНК үлгүлөрүнүн жетишсиздигине туш болобуз, мисалы, кичинекей анатомиялык ооз шишиктерин, ал тургай бир клеткалуу үлгүлөрдү жана адамдын клеткаларында өтө төмөн деңгээлде транскрипцияланган спецификалык ген мутацияларынын үлгүлөрүн изилдөө үчүн.Албетте, COVID-19 тести үчүн, эгерде тампондор туура жерде болбосо же үлгү алууда жетиштүү убакыт болбосо, үлгүнүн көлөмү өтө аз болот, ошондуктан Саламаттыкты сактоо жана үй-бүлөнү пландаштыруу комиссиясы эки күн мурун чыгып, сыноодон өттү, жана нуклеин кислотасынын үлгү алуучу алты үлгүнү албаса, сиз бул тууралуу кабарлай аласыз.
Реагенттин сезгичтиги маанилүү, анткени бизде бул же тигил көйгөй бар, андыктан RT-PCR сезгичтигин жакшыртуу үчүн эмне кылсак болот?
Мүмкүн болгон чечимдерди талкуулоодон мурун, биз айтып өткөн кырдаалдын эки чоң татаалдыгын айта кетели.
Биринчиден, биз үлгүдө бир нече гана клетка популяциясы болгондо РНКны жоготуудан тынчсызданабыз.Эгерде салттуу бөлүү жана тазалоо ыкмалары, мисалы, мамыча ыкмасы же нуклеиндик кычкылды тутандыруу ыкмасы колдонулса, бир нече үлгүлөр жоголуп кетүү ыктымалдыгы жогору.Чечимдердин бири – ташуучу молекуланы, мисалы, тРНКны кошуу, бирок ошондо да биздин калыбына келтирүү экспериментибиз жакшы экенине кепилдик жок.
Анда кандай жакшы жол бар?Маданияттуу клеткалар же микроанатомиялык үлгүлөр үчүн жакшы вариант түз лизисти колдонуу болуп саналат.
Идея клеткаларды 5 мүнөткө бөлүп, РНКны эритмеге бошотуп, андан кийин реакцияны 2 мүнөткө токтотуп, андан кийин РНК жоголбоосу үчүн лизатты түздөн-түз тескери транскрипция реакциясына кошуп, акыры келип чыккан cDNAны түз коюу. реалдуу убакыт реакциясына.
Бирок, эгерде чектүү башталгыч чекиттен же максаттуу гендин аз сандагы экспрессиясынан улам, биз бардык РНКны кайра иштетип алсак, бирок реалдуу убакытта жакшы сигнал алуу үчүн жетиштүү калыптарды бере албасакчы?
Бул учурда, алдын ала күчөтүү кадам абдан пайдалуу болушу мүмкүн.
Төмөндө тескери транскрипциядан кийин сезгичтикти жогорулатуу схемасы келтирилген.Баштоодон мурун, алдын ала күчөтүү үчүн бул максаттар үчүн конкреттүү праймерлерди иштеп чыгуу үчүн, биз кайсы максаттарга кызыкдар экенибизди төмөнкү агымдан сурашыбыз керек.
Буга 100 жупка чейин праймерлер жана 10-14 жолу реакция цикли бар аралаш праймерди түзүү аркылуу жетишүүгө болот.Ошондуктан, бул талап үчүн атайын иштелип чыккан Master Mix алынган cDNAны алдын ала күчөтүү үчүн керек.
Циклдердин санын 10дон 14кө чейин коюунун себеби, бул чектелген сандагы цикл сандык молекулярдык маалыматка муктаж болгон изилдөөчүлөр үчүн өтө маанилүү болгон ар кандай максаттардын ортосундагы кокустукту камсыздайт.
Алдын ала күчөтүлгөндөн кийин, биз cDNAнын чоң көлөмүн ала алабыз, андыктан арткы чекиттеги аныктоо сезгичтиги бир топ жакшырат жана биз үлгүнү суюлтуп, мүмкүн болгон кокус каталарды жок кылуу үчүн реалдуу убакыт режиминде бир нече ПТР реакцияларын аткара алабыз.
Посттун убактысы: 2023-жылдын 11-апрели